棉花叶皱缩病毒诱导的基因沉默体系的建立及其应用

【摘要】棉花是世界上最重要的经济作物之一,开展棉花抗病虫、抗逆境等功能基因的研究对于提高棉花的产量和品质以及棉花产业的发展具有巨大的推动作用。生产上广泛使用的陆地棉和海岛棉均为异源四倍体,生长周期长,基因组比较大,遗传转化效率低,使得传统的T-DNA插入和化学诱导的突变等方法很难用于棉花功能基因组学的研究。因此,迫切需要建立一套快速、高通量的反向遗传学手段对棉花的功能基因开展相关研究。本论文将原本只适用于基因枪轰击的棉花叶皱缩病毒(Cottonleafcrumplevirus,CLCrV)载体改造为适用于农杆菌浸润的病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体pCLCrVA。该载体能与CLCrV的DNA-B组份共同侵染棉花,且不产生表型。利用该体系不仅可以在棉花中开展基因功能研究,而且可以用于过量表达microRNA(miRNA)、短串联靶标类似物(shorttandemtargetmimic,STTM)和人工miRNA(artificialmiRNA)。利用该载体我们在棉花中有效的抑制了镁离子螯合酶亚基Ⅰ型(CHLI)和延长因子1α(EF-1α)这两个内源基因以及转基因棉花中苏云金杆菌crylA基因的表达量。此外,利用该载体还可以在陆地棉植株中异源过量表达miR156,引起miR156的靶标mRNA的表达量下降,产生叶片发育异常的表型。该载体还可用于在棉花体内异源表达针对miR165/miR166的STTM结构从而抑制miRNA的功能,产生叶片下卷和皱缩的症状,并且导致miR165/miR166的靶标mRNA的表达量显著提高。经过改造的CLCrVVIGS载体操作简便,能够在多个不同的棉花品种上引起稳定、持续的基因沉默表型,为棉花功能基因组的研究提供了强有力的手段。利用CLCrV沉默载体,开展了棉花功能基因的研究。LYK(LysinMotifReceptor-LikeKinase)家族蛋白是一类重要的受体蛋白,在拟南芥、水稻等植物抵抗真菌侵染过程中扮演了重要角色。为了研究LYK蛋白在棉花抗黄萎病中的作用,利用生物信息学的方法从棉花基因组中寻找到拟南芥LYK的5个同源基因,命名为GhLYK1至GhLYK5。利用qRT-PCR检测发现,棉花抗病品种3503受到大丽轮枝菌侵染后LYK家族的Gh-LYK1和Gh-LYK2的表达量明显上调。利用CLCrV载体分别沉默了Gh-LYK1和Gh-LYK2之后再接种黄萎病菌,发现与非沉默植株相比,沉默Gh-LYK1或Gh-LYK2的植株对黄萎病的抵抗力减弱,病情指数显著升高,表明Gh-LYK1和Gh-LYK2在棉花抵抗黄萎病中具有重要作用。利用几丁质结合实验发现Gh-LYK1和Gh-LYK2的胞外区均能够结合几丁质；利用体外磷酸化实验发现Gh-LYK1的胞内区具有激酶活性,但是Gh-LYK2的胞内区虽然预测有激酶的功能域,但该功能域是没有活性的。通过序列分析发现棉花感病品种ZN905和Jun1的Gh-LYK2均缺失了跨膜区。在感病品种Zn905中沉默Gh-LYK2后,沉默植株对大丽轮枝菌的敏感性没有增加,表明缺失了该基因在感病品种中不起作用。对Gh-LYK2的亚细胞定位进行分析,发现感病品种中的Gh-LYK2虽然缺失了跨膜区,但其仍然定位于细胞膜。我们推测跨膜区的缺失导致Gh-LYK2穿过磷脂双分子层时,部分LysM功能域嵌入了磷脂双分子层,导致其识别几丁质的能力丧失,从而失去功能。下一步将继续研究跨膜区在识别几丁质信号传递中的作用。
【作者】顾周杭；
【导师】周雪平；
【作者基本信息】浙江大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】棉花；病毒诱导的基因沉默；microRNA；黄萎病；LysM-containingkinase；

【参考文献】
[1]司马冰.数据挖掘开发企业的金矿[J].数字化工,2004,07:91-92.
[2]张乐.基于AdaBoost集成PSO-RBF的高速公路交通事件检测算法研究[D].西南交通大学,交通信息工程及控制,2014,硕士.
[3]郑玲.我国行政审批制度改革研究[D].南京师范大学,行政管理,2012,硕士.
[4]张昊.宏观经济波动、股权结构与融资偏好[D].浙江财经学院,会计学,2013,硕士.
[5]刘西茜.双边市场理论视角下微博的商业化模式研究[D].江西财经大学,产业经济学,2013,硕士.
[6]刘博.中国EFL学习者对英语权势词的心理表征[D].四川外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[7]郑世保.ODR裁决书强制执行机制研究[J].法学评论,2014,03:161-169.
[8]王静.促进工程项目管理信息化研究[D].北京建筑大学,项目管理,2013,硕士.
[9]李亮.基于FPGA的红外与可见光视频实时融合系统[D].南京理工大学,光学工程,2013,硕士.
[10]李健花.‘金帅’苹果无锈芽变品种鉴定与防锈技术的研究[D].南京农业大学,果树学,2013,硕士.
[11]缪大经,周秉谦.金箔专用载体——乌金纸[J].包装世界.1996(05)
[12]杨建芳.对《小镇畸人》中交流的失败及畸人出路的解析[D].华东师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[13]施晶晶.企业社会责任对消费者购买意向影响的实证分析[D].宁波大学,企业管理,2012,硕士.
[14]贺园.二元转型过程中货币对价格影响机制的变异[D].浙江理工大学,产业经济学,2014,硕士.
[15]卢海波.常规靶场网络化实时交会测量方法研究[D].中国科学院研究生院（长春光学精密机械与物理研究所）,光学工程,2004,硕士.
[16]谢彦博.广梅园招商引资项目准入风险评估体系构建研究[D].华南理工大学,工业工程,2012,硕士.
[17]张润顺,王映辉,刘保延,周雪忠,何丽云,宋观礼.基于共享系统的真实世界中医临床研究范式初步实施方案的设计[J].中医杂志,2014,18:1551-1554.
[18]裴子秀.基于以太网的列车通信网络性能研究[D].西南交通大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[19]贾旭聪.公司财务报表重述与财务报告内部控制的研究[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[20]杨文彬,张丽,刘菁伟,刘欢锐,唐兵华.石墨烯复合材料的制备及应用研究进展[J].材料工程,2015,03:91-97.
[21]邓之银.基于拉曼光谱的油品快速检测技术与实验研究[D].浙江大学,光学工程,2014,硕士.
[22]陈文娟.金属/TiO_2薄膜复合光催化剂的可见光催化性能研究[D].苏州大学,材料物理与化学,2014,硕士.
[23]李涛.刑事侦查社会参与制度研究[D].西南政法大学,诉讼法,2012,硕士.
[24]戴小英.差分演化算法及其改进算法集成界面的实现[D].华中科技大学,生物医学工程,2013,硕士.
[25]祁睿.电力上市公司治理结构与公司绩效关系研究[D].山西财经大学,会计学,2013,硕士.
[26]本报记者矫月.奥宇集团借道银基发展曲线上市3.22亿元石墨资产置入[N].证券日报,2013-08-19C04.
[27]段巍.小流域原生态群落人居环境营造艺术研究[D].中央美术学院,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[28]陈思联,　邵成伟,　惠卫军,　董　瀚,　郝彦英.胀断连杆用高钒中碳钢的动态再结晶行为[J].钢铁研究学报.
[29]陈校,黄运榜.基于粒子群算法的音圈电机参数辨识[J].机械工程与自动化,2014,06:52-53+56.
[30]王筠.功能对等指导下的政府工作报告英译研究[D].华中师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[31]潘源虎.川大黄抑制慢性肾功能衰竭有效成份研究[D].湖北中医学院,中药学,2004,硕士.
[32]张元辉.200MW汽轮机组快速冷却优化研究[D].重庆大学,动力工程,2003,硕士.
[33]李瑞鹏.松质骨/水凝胶支架构建类骨软骨复合物[D].大连理工大学,化学工程,2013,硕士.
[34]李书玲.改进型RBF神经网络的多标签算法研究[D].华中师范大学,电路与系统,2014,硕士.
[35]韩生廉,葛万成,武晓今.基于模糊关系的信息检索系统设计方法[J].控制与决策,2001,S1:733-736.
[36]郭敏.不动产登记纠纷民事与行政交叉问题之研究[D].山东大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[37]黄静惠.从社会伦理角度看语境对言语交际的影响[D].广西师范大学,语言学与应用语言学,2013,硕士.
[38]张敏.美国与土耳其联盟关系研究[D].上海外国语大学,国际关系,2012,硕士.
[39]智朴.兴隆洼文化陶器分期及相关问题研究[D].辽宁大学,考古学及博物馆学,2012,硕士.
[40]徐勃.“无意识设计”理念与厨房文化[D].安徽大学,艺术设计,2014,硕士.
[41]侯世全,宋晓明.新建铁路南疆线库尔勒-喀什段生态环境影响的调查[J].中国铁路.2002(10)
[42]孙柏峰.吉林省某市空气质量评价及预测[D].吉林大学,环境工程,2013,硕士.
[43]AMPanich,VYuOsipov,KTakai.用NMR研究洋葱碳吸附水后的抗磁性（英文）[J].新型炭材料,2014,05:392-397.
[44]王纪武,张显文,高伟杰,廖方波,李建勇.基于机器视觉的钢轨轨头非接触测量精度研究[J].北京交通大学学报,2014,01:132-135.
[45]贺建军,张俊星,贾思齐,刘文鹏,许爽,崔艳秋.一种新高斯过程分类算法[J].控制与决策,2014,09:1587-1592.
[46]李莉.公益导向的公立医院战略绩效评价研究[D].湘潭大学,公共管理,2011,硕士.
[47]张源珊.房产信息管理法律问题研究[D].华中师范大学,法律,2014,硕士.
[48]李伟庆.沁水县城镇企业职工养老保险问题研究[D].山西财经大学,社会保障,2014,硕士.
[49]张坤.直线基准的测量修正技术和直线度评定方法研究[D].华中科技大学,精密仪器及机械,2013,硕士.
[50]马爱梅.东莨菪碱对实验性大鼠惊厥阈值、惊厥行为及脑内部分神经递质的影响[D].山西医科大学,神经病学,2002,硕士.